慢病毒包装

        慢病毒属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期，其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒（HIV-1）。HIV-1直径约120nm，含两条正链RNA，可有效的进入细胞核中，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。对以HIV-1为基础进行的慢病毒载体的改造，主要是去除致病基因减少辅助质粒与载体质粒的同源性，最终体现在滴度、生物安全性和外源基因表达效率上的提高，见结构示意图。        慢病毒包装系统特点：可通过顺式作用元件将携带的基因运送到细胞核，将要表达的基因序列整合到细胞基因组中，后续可以通过筛选稳转株获得持续稳定的高表达。

        体外实验多用于感染各种难题转染细胞，建立稳定表达或沉默目的蛋白的细胞株。也可用于基因治疗、动物模型的制备等。

RNAi慢病毒感染骨肉瘤细胞图片及qPCR检测干扰效果

腺病毒包装

        腺病毒是直径约80-120 nm的无包膜的线性双链DNA病毒，可迅速感染分裂和非分裂期细胞，与细胞表面受体结合后通过内吞作用进入细胞，在细胞核孔附近聚集，并在感染后2h将腺病毒的DNA释放到细胞核中并开始蛋白表达。通过对野生腺病毒进行改造，保留包装信号序列，去除病毒蛋白的编码序列，不仅增加外源基因的装载容量，而且降低细胞毒性和机体免疫反应，从而获得安全性更高的基因导入系统。

        腺病毒包装系统的特点：不整合到宿主细胞基因组，无插入致突变性；可进行有效扩增，获得高滴度高纯度的腺病毒。

        体外实验可快速有效地将目的基因或RNAi片段导入靶细胞，研究目的基因功能。

免疫组化技术服务

免疫组化，是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术

组织样本处理

    包括石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片/涂片石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等.

 ​免疫荧光

    免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

原位杂交

    将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。

    RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体 (Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

服务内容

1.细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；

2.感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测；

3.癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；

4.基因在染色体上的定位；

5.检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；

6.分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。

荧光标记的原位杂交技术

 将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

原位末端标记染色

    细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。

抗原诱导T淋巴细胞检测

平台采用第三代 CTL 活性的检测方法提供了更全面的 T细胞表型和功能信息。这些分析方法可以多方面提供 T 细胞活性的信息，包括T细胞杀伤效应、增殖以及迁移潜能等。

1.Caspase 抗体标记

标记凋亡靶细胞 T 细胞受体识别靶细胞表面的 MHC-抗原肽复合物后，CTL 即可释放穿孔素及粒酶或者激活 Fas/FasL 信号通路，靶细胞继发 caspase 瀑布级联反应，从而发生凋亡，其 中 caspase-3 是一个重要的凋亡指示蛋白，在凋亡发生的早期就可以被激活。利用细胞示踪染料 DDAO-SE 标记 P815、EL4 和 T2 淋巴瘤细胞，并 用 caspase-3 抗体对凋亡细胞染色。该方法用于检测一些人和鼠的抗原特异性 CTL 活性是安全、可靠的。利用可穿透细胞膜的 荧 光 标 记 caspase，检 测 CTL 诱 导 的 靶 细 胞caspase 激活，比传统的51Cr 释放法更快、更安全、更敏感，能在单个细胞水平检测靶细胞，并可与其他检测方法同时进行。

2.Annexin V 标记

标记凋亡靶细胞 ，磷脂酰丝氨酸是一种磷脂，正常情况下分布在细胞膜内侧，细胞凋亡时外翻到细胞表面，可与外源性的 Annexin V 高亲和力结合，从而区分细胞是否发生凋亡。将效应细胞与靶细胞共孵育后，用 PE 结合效应细胞特异性单克隆抗体并标记效应细胞，不能与 PE-mAb 结合的细胞即为靶细胞，再用 FITC 标记的 Annexin V 来检测细胞凋亡时出现在细胞表面的 PS。该方法与51Cr释放法在检测细胞毒性方面有明显相关性。 

3.PI 或 7-AAD 标记

标记死亡靶细胞 评价靶细胞死亡的方法中应用最广泛的是检测 DNA 嵌入荧光剂的摄取，如 PI，可因死亡靶细胞膜通透性增加而进入细胞内，与 DNA 嵌合。已经有很多方法联合荧光染料和 DNA 嵌入染料来直接鉴别死亡细胞，特别是Annexin V-FITC /PI 双染法，已被广泛用于区别细胞凋亡与死亡。这种方法有效，毫不逊色于51Cr 释放法，且更快、更容易操作。7-AAD 是一种最常用的 PI 替代物，也可以穿透死细胞的细胞膜，插入到核酸的双链中，研究证明死亡的靶细胞摄取 7-AAD 和 PI 的水平几乎相同。被荧光标记的 Annexin V 与靶细胞膜结合，同时加入PI 或 7-AAD，可以检测细胞凋亡，并在单细胞水平上区分细胞凋亡的不同阶段。

该方法简单、可靠，应用广泛，但是不能区分晚期凋亡细胞和坏死细胞，而且必须要用活细胞来检测，对细胞的活性要求较高，应该是状态最好的时候进行检测。 

4 溶酶体相关膜糖蛋白( LAMPs) 抗体标记

标记效应细胞脱颗粒 细胞毒颗粒，即粒酶和穿孔素是膜包被的溶酶体，CTL 通过胞吐作用将其释放后介导细胞死亡。包绕细胞毒颗粒的脂质双层结构包含溶酶体 相 关 膜 糖 蛋 白 ，包 括 CD107a ( LAMP-1) 、 CD107b ( LAMP-2) 和 CD63 ( LAMP-3) 。CTL 在适当的刺激下，微管发生移动，将颗粒运送到 CTL 的质膜，随后质膜发生融合，粒酶和穿孔素被释放到突触中，继而发生脱颗粒，导致靶细胞死亡。在脱颗粒过程中，溶酶体膜和细胞膜融合的结果是，溶酶体膜表面的糖蛋白可表达于细胞表面，溶酶体相关膜糖蛋白( LAMPs) 抗体与其结合，可标记效应细胞脱颗粒过程。

流式细 胞 仪 检 测 CD8 + T 细 胞 上 CD107a 和 CD107b 的表达作为一种可靠的临床监测方法，已获得越来越多的认可。通过流式细胞仪检测细胞膜上 CD107a 的表达，建立了一种可量化评价 NK 细胞及 CTL 细胞毒性的方法，该方法可以快速、有效的筛查细胞毒性缺陷相关的疾病，如家族性噬血细胞淋巴组织增生综合征及其他原发性免疫缺陷继发的疾病。

5.其他方法

除了上述方法外，根据平台丰富的CTL相关实验经验，还有：

CTL 表面 TＲAIL 及 Fas- L 的检测，可以反映其活化程度和杀伤能力; 

CTL 细胞因子受体及粘附抗原的检测，可反映其迁移能力; 

CFSE 稀释法可反应细胞的增殖能力; 

CTL 对稀释后不同浓度抗原的反应，提示 TCＲ 与特异性抗原的亲和力; 

抗原标记的树突状细胞在体内的存活也可反映 CTL 的活性，等等。

质粒载体可以有效地运载外源基因片段进入受体细胞，可以独立自主大量复制并且很容易从宿主细胞中分离纯化，因而在分子生物学使用十分广泛。常用的载体可分为克隆载体和表达载体，根据载体进入受体细胞的不同，分为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体以及穿梭载体。用于目的基因的表达研究；基因、蛋白的功能研究。

质粒载体构建

继植物中发现基因沉默现象后，动物细胞中的双链RNA诱导的基因沉默现象也被阐明，并于2006年获得诺贝尔医学奖的肯定，足以说明RNAi技术在医学领域即将发挥的开创性作用。siRNA（Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA，由Dicer酶加工双链RNA而成。siRNA与体内多种酶类结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），从而激发与之互补的目标mRNA的降解。天然的RNAi现象存在于包括人类在内的动植物体内，在调节基因表达和预防病毒感染方面起到重要作用。应用于基因功能的体内外研究，RNAi类药物研发

siRNA的细胞转染及筛选

早期的shRNA载体多采用RNA聚合酶III型启动子介导shRNA的表达，RNA聚合酶III型启动子如鼠源的U6启动子和人源的H1启动子可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。随着miRNA干扰机制的深入研究，发展出第二代siRNA载体，即采用RNA聚合酶II型启动子CMV表达含侧翼序列的miRNA模拟物（见图2.2）。该载体模拟miRNA的加工，表达出来的shRNA进入RISC沉默复合物的效率要比RNA聚合酶III型启动子表达的shRNA高倍十倍，抑制效率更好，且可以和EGP协调表达，方便观察转染效率。

shRNA载体构建及筛选

shRNA载体构建及筛选

    核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸提取也成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。核酸提取也是临床分子诊断最关键的操作，直接关系到实验的成败与否，是临床分子诊断容易发生问题的步骤。

    高质量的DNA和RNA是基因获取的前提条件，依托市面上成熟可靠的DNA/RNA提取试剂盒，针对动植物组织、血液、细菌、真菌及石蜡、水样等特殊样品。结合熟练细心的实验技术人员完成实验，我们能为客户提供高质量的DNA/RNA样品，满足客户下游实验（普通PCR，QPCR，文库构建，基因提取，分子标记等）的需求。